定量PCR仪新应用
定量PCR仪新应用
2011/11/15 11:01:48
定量PCR仪新应用：SNP和基因突变检测
定量PCR仪最主要的功能是测定样品中DNA或RNA的浓度，但是也不仅仅局限于此。如果定量PCR仪的硬件和软件设计精良，具备多色检测能力，运用的又是分子生物学中应用广泛的基本原理，如TaqMan探针，就为用户灵活运用、开拓新的研究和 应用留下了很大余地，可以开展单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)研究、等位基因鉴定、基因突变检测、正/负检测等许多项目。因为TaqMan探针杂交本质上就是分子杂交，凡是用到分子杂交的研究，都可以通过定量PCR来完成。
1. TaqMan探针技术原理
探针是与目标核酸序列专一性结合的核酸片段，用于探测、确认和定量样品中的目标序列。由于结合是特异的，检测出来的只能是目标序列，而不是其同源片段。当然这需要在设计探针时进行全基因组的同源性扫描(如BLAST)来保证。
如果希望检测基因中的点突变或SNP位点，要用到两条不同的探针：一条针对正常或主要的序列，一条针对突变或少数的序列。TaqMan探针杂交检测的原理 与Southern和Northern杂交一样。为了探测探针的存在，需要在探针上作一些标记，常用的如放射性核素、地高辛、生物素、荧光基团等。荧光标 记由于既安全又灵敏，是当前的标记主流。
为了区别，需要在不同的探针上标记不同颜色的荧光基团。为了只检测杂交成功的探针所产生的荧光信号，需要在探针上再加一个淬灭基团：探针完整时，报告基团 发射的能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号；探针断裂后，两种基团相距遥远，无法淬灭，仪器才能检测到信号。这样的探针就是TaqMan探针。为了在探 针断裂与探针杂交之间建立联系，同时放大信号强度，需要利用PCR过程：一方面利用Taq酶的5’→3’链延伸活性，完成PCR，放大DNA；另一方面利 用其3’→5’核酸外切酶活性，在链延伸过程中同时切断探针，产生荧光信号。将探针置于两条引物之间，则Taq酶切断的探针都是与模板DNA杂交结合的； 而且，每生成一条PCR产物，切断一条探针，产生一个单位的荧光信号，所以信号强度与PCR产物数量同步增长。
SNP分析、基因突变检测、等位基因鉴定、正/负检测等应用虽然相去甚远，但共同点都是检测样品中的两种不同片段：不同的SNP多态、正常和突变的基因、 不同的等位基因等等，所以都可以应用TaqMan探针技术。作定量PCR，需要1对PCR引物和1条探针；作等位基因鉴定则需要1对引物和2条探针。定量 PCR是实时动态检测，确定CT值；等位基因鉴定只需要在PCR完成后检测总的荧光信号。这是它们之间的区别。
TaqMan探针的淬灭基团有两种：普通的TaqMan探针淬灭基团是TAMRA，它也发射荧光，构成本底的一部分；MGB探针则采用非荧光淬灭基团 (Non-Fluorescent Quencher，NFQ)，本身不发荧光，所以信噪比更高，探测更灵敏。MGB探针上另外还有一个MGB (Minor Groove Binder)基团, 它可以在不增加长度的情况下将探针的Tm值提高10°C左右，因此MGB探针可以设计得更短。这一方面降低了探针合成的成本，一方面也大大增加了探针设计 成功的机会。另外，实验证明，MGB探针对于富含A/T的模板可以区分得更为理想。
2. SNP分析
2.1. 定义和分类
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)是指在基因组水平上由单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性，即基因组内特定位置上存在两种不同的碱基，其中少一种在群体中的频率不小于1%。
单个碱基的改变在人群中的发生频率(等位基因频率)只能在0%到50%之间。如果等位基因频率<1%，一般称为基因突变，而不是多态性；等于50%，称为杂合子；二者之间的才是多态性。绝大多数SNP是二态性的，只有2种等位基因。
SNP是人类可遗传变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90%以上。人基因组平均每1000个碱基中就有1个SNP，至2002年6月，总数400多万个。
SNP主要根据它们在基因组中所处的位置和生物学效应分类，见表1。
表1 SNP分类
| 位置 | 对基因功能的影响 | 类型 | 生物学效应 |
| 编码区 | 沉默，如UUG CUG，都编码Leu。 | sSNP | 通常不改变表型。 |
| 编码区 | 导致氨基酸改变，如UUC UUA导致Phe Leu。这种SNP不多见但是最有价值，可能被专利保护。 | cSNP | 改变表型。由于氨基酸置换的类型和部位不同，作用微妙。 |
| 编码区 | 导致终止密码，如UCA UGA导致Ser Stop。 | cSNP | 改变表型。 |
| 调控区 | 提高或降低转录速率。 | rSNP | 可能改变表型。 |
| 其他 | 最常见，对基因产物没有影响(?)，作为多基因遗传病的遗传标记。有人称之为Anonymous SNP。 |
如果cSNP或rSNP导致蛋白质的功能或表达发生变化，也称为pSNP。在人类基因组中，cSNP或pSNP约占全部SNP的2%，也就是大约8万个。
2.2 研究意义
SNP的应用范围较微卫星标记更加宽广，对群体遗传学、制药业、法医学、癌症及遗传性疾病甚至进化的研究都将产生不可估量的影响。人们希望通过研究SNP图谱，更深刻地认识癌症、糖尿病、血管性疾病和某些精神性疾病等发病率高的多基因疾病的发生机制。
(1) 遗传病致病基因的连锁定位
SNP作为遗传标记，可以用来进行单基因和多基因遗传病的连锁分析(linkage analysis)或关联分析(association analysis)。在疾病易感基因的定位方面，SNP的定位精度比微卫星标记精细得多，可以直接用于指导易感基因克隆。
人类的遗传连锁图谱至今已发展到了第三代。第一代是限制性片段长度多态性(RFLP)图谱，第二代是微卫星图谱，第三代是SNP图谱。SNP的优点在于： (1) SNP是二态性的，在任何人群中其等位基因频率都可估计出来；(2) SNP在基因组中的分布比微卫星标记更广泛；(3) SNP是相对稳定的，而STR的高突变率容易导致在人群遗传分析时出现困难；(4)部分SNP会直接影响到蛋白质结构或基因表达水平，本身可能就是疾病遗传机制的候选改变位点。
(2) SNP与药物遗传学和药物基因组学
个体化用药。同一种药物，对不同的病人治疗效果有时差异显著。造成这种差异的原因是由于药物在不同的个体内活化、代谢和清除等方面的基因差异所决定的，这 种差异主要是SNP。研究SNP与药物的个体敏感性或耐受性之间的关联，可以阐明与药物疗效以及毒副作用相关的SNP基因型，从而为针对性地使用药物提供 依据。这就是所谓的“药物百家姓”。
为寻找新药提供依据。药物基因组学研究遗传因素对药物作用的影响和不同基因型个体对药物反应的差异，从而为根据不同基因型群体对药物的反应来改进药物设计 提供理论依据。这是当前制药行业对SNP表现出空前兴趣的原因。目前FDA在批审的新药中至少有15种新药要求进行病人的基因分型。
2.3 SNP基因分型的研究方法
SNP研究分为3个阶段：发现，常用重复测序和in silico分析技术；确认并测算其等位基因频率，常用单碱基延伸技术；筛查，也就是开展与SNP有关的研究项目，一般采用5’核酸酶试验和MGB探针技术。
SNP基因分型研究方法的选择应该从以下几个方面进行评估：准确性、操作自动化程度、通量高低和每一个样本的分析成本。考虑这些因素，荧光定量PCR是临 床基因分型研究的首选技术平台。准确：TaqMan MGB探针的长度只需13-18个碱基，一个碱基的不同可以使两种探针的Tm值相差18度，检测SNP的准确性极高。方便：操作与PCR一样，是所有分型 方法中最简便的，而且是目前唯一的一步扩增即可完成的SNP基因分型方法。试剂盒商品化：如ABI公司提供20万个位点的SNP基因分型试剂盒，构成一个 以功能基因为中心的、高分辨率的定位标记图谱，是疾病研究、侯选药物筛选和药物疗效关联研究的有力工具。
2.4 TaqMan探针技术在SNP研究中的应用
在SNP基因分型的PCR反应体系中包括1对引物和2条探针。这2条探针分别针对SNP的两种等位基因，并分别被标记上不同颜色的荧光基团。如果使用 ABI公司的Assays-on-Demand试剂盒，实验操作非常简单：加入基因组DNA，PCR 预混液和Assays-on-Demand试剂盒（内含所需的引物和探针），即可在7000或7900上按标准的反应循环条件作PCR。在PCR完成后， 仪器根据检测到的荧光信号的颜色来自动判断样品中存在哪种等位基因，给出结果。结果总共有3种可能：两种等位基因各自的纯合子和杂合子。只有一种信号出现 是纯合子，如果两种信号同时出现，就是杂合子。典型的SNP筛查结果见图3(略）。
3. 基因突变检测、等位基因鉴定和+/-检测
这些应用在技术原理上和PCR操作上与SNP研究几乎一样，其PCR反应体系中也包括1对引物和2条探针，其区别仅仅是生物学意义上的，也就是研究的目的 和对实验数据的解释不同。基因突变检测是分析样本中的某个基因是正常的还是带有已知的点突变；等位基因鉴定是分析样本中存在哪种等位基因；+/-检测则分 析样本中某个特定基因或核酸片段的有无——都是通过分别针对两种等位基因探针及其荧光标记颜色来实现的。一般地说，包括SNP研究在内，所有这些应用都可 以统称为等位基因鉴定。
所有的等位基因鉴定实验，包括SNP分析和点突变测定，都要求定量PCR仪具备多色检测能力，能够在同一个反应管中同时检测多个荧光信号，具体地说就是， 至少2种报告荧光信号，外加1种淬灭荧光信号和1种参比校正荧光信号，总共4种。否则的话，如果仪器只有单色检测能力，即使能够将同一个样本分成两份，进 行两次检测，还少了校正信号，无法消除取样量等偶然误差，既增加了费用，又降低了等位基因判定的可信度。
4. 荧光信号的归一化
等位基因鉴定也要注意实验数据的归一化，特别是荧光信号强度的校正，以保证结果的严格可靠。
加样操作误差、离心管盖透光性能差异、不同反应管之间荧光激发效率差异等偶然因素实际上不可避免，仪器收集到的原始信号必然有波动，只有在归一化之后，才 可以相互比较并保证重现性。这种校正是通过在反应缓冲液中添加校正荧光(通常是ROX)来实现的。ROX在缓冲液中的浓度是固定的，因此其信号强度与反应 体积和荧光激发效率等各种因素的总和正相关。仪器同时收集反应信号和校正荧光信号，然后反应信号除以校正信号，消除上述误差的影响，极大地提高了等位基因 判定的准确度。
无论忽视ROX校正的重要性，还是由于所使用的定量PCR仪没有多色检测能力而不做ROX校正，都是不严格的。