迁移率变动分析法

2010/08/17 12:59:42

安全注意事项：

①丙烯酰胺和双丙烯酰胺为强神经毒素，可被皮肤吸收且具有累积效应。在称取时应戴手套面罩。

②聚丙烯酰胺可被视作无毒，但仍需小心操作，因为其中可能还含有少量未聚合成分。

③操作放射性物质需戴手套。并向当地安全部门咨询有关放射性物质的合理使用规程。

聚丙烯酰胺凝胶的制备

1、组装电泳装置并洗净玻璃板。

2、按下表配制4%非变性丙烯酰胺凝胶溶液：丙烯酰胺/双丙烯酰胺（29:1）4 ml，TBE（10 ×）3 ml，ASP（10%）200 μl，TEMED 40 μl。可灌制成1~1.5 mm厚的凝胶。凝胶聚合约需1 h，使用前可于室温下保存1天。

注意：所需试剂的量因凝胶的大小和厚度而调配。

DNA-蛋白质结合反应

1、将10 mg/ml的poly（dI-dC）·Poly（dI-dC）贮液用无菌双蒸水稀释成终浓度6 μg/μl。 将6 μg/μl的poly（dI-dC）·poly（dI-dC）溶液与32 mmol/l（pH8.0）的EDTA等体积混合，配制成工作溶液。用片段重悬缓冲液将32P标记的DNA片段稀释至终浓度2 fmol/μl。

2、对于标准DNA-蛋白质结合反应，按下表顺序将下列试剂加入1.5 ml微量离心管：32P标记的DNA片段（2 fmol/μl）0.5 μl， poly（dI-dC）·Poly（dI-dC）+ EDTA工作溶液0.5 μl（即3 μg/μl的poly（dI-dC）·Poly（dI-dC）+ 16 mmol/l EDTA），核抽提液和/或透析缓冲液9 μl，总体积10 μl，吹吸混匀。

注意：①为了检测未标记DNA片段的迁移，应另取一管，用9 μl透析缓冲液代替核抽提液，作为对照；②为了标定核抽提物结合DNA的活性，应作几管核抽提物用量由少到多（至9 μl）而DNA片段的量一定的平行反应，由此来确定DNaseⅠ足迹法中适宜的核抽提物用量。务必使全部的标记DNA片段均被蛋白质结合。如果在最大核抽提液用量（如9 μ1）下，仍不能全部结合标记DNA片段，则有必要将核抽提液进一步浓缩。③迁移率变动分析法还可用于鉴定蛋白质与特定DNA片段结合是否具有特异性。鉴定方法是向反应体系中加入过量的非标记竞争物DNA片段。一般加入摩尔浓度过量100倍和500倍的其他竞争物，所有竞争物都以这两种浓度加入，并将100倍过量与500倍过量的反应物分别上样于两条泳道中。若DNA与蛋白质结合具有特异性，则同源片段会竞争蛋白质的结合位点，而无关片段则不具有竞争性。要获得特异性结合，需要改变反应中poly（dI-dC）·Poly（dI-dC）竞争物的量或者改变所用的非特异竞争物的类型（例如可选用剪切的鲑精DNA片段）。

3、室温温育45 min，此时可将凝胶在100 V预电泳10~15 min。

4、温育结束后，可不加染液直接将样品加在凝胶上。在一个上样孔中单独加入10 μl含0.05%二甲苯青和0.05%溴酚蓝的透析缓冲液（即此孔中不加待测样）用来跟踪电泳进程。

5、用1×TBE缓冲液在约10 V/cm条件下电泳约2 h。具体时间取决于所使用的DNA片段的大小（参见Sambook et al，1989）。

注意：在使用说明中，此类凝胶经常用可循环使用的Tris/EDTA或甘氨酸缓冲液来电泳，并需加压上样。但在本试验中，电泳带的清晰度和DNA片段的结合的百分比并无随电泳缓冲液或上样条件发生明显变化的现象。

6、小心地把凝胶转移到Whatman 13MM滤纸上并用保鲜膜覆盖在凝胶上。80℃用凝胶干燥器干燥凝胶约1h。

7、室温下把干燥凝胶对X光片曝光过夜。