包涵体表达小技巧
包涵体表达小技巧
2009/09/12 05:24:58
包涵体表达小技巧之一：快速增值和收获包涵体
看到这么多厉害的技术，只能感慨自己落后了，写点常规基本技术充充门面吧。
关于包涵体蛋白表达，菌种BL21（DE3），质粒PET41，双抗，内藏目标蛋白X。
牛牛菌种的获取：100ml LB液体培养基，加入2-5倍于常规的抗生素量，再1：50加入已经转入质粒的菌种，220 rpm 37度，转啊转，转法是，选择底部有凹凸的瓶子，或者把你的瓶子倾斜（水平夹角约70度），目的是保证转的过程中培养基溶解大量空气进去（有泡沫为证），我发誓，它们喜欢这个。当培养基的OD600达到0.5或略低于0.5（摇之前做好对照啊），收菌，做成含30%-50%甘油的储备菌，-80保存。这种菌，由于培养基抗生素含量高，所以都是“摔打”出来的，而且还处在对数期，为年轻一代，故称牛牛菌种。选一个无聊的上午接菌，晚饭前就有甘油菌了。
表达开始在一个慵懒的上午，早上8、9点，手持你的甘油菌快速解冻，1：100加到100ml含有正常量抗生素的LB液体培养基中（不用超标加抗生素了），220 rpm 37度，注意还是要溶解很多空气进去，保证它们喜欢。
2个到2个半小时后，也就是11点左右，把你唤醒的菌种1：100接到你的大瓶培养基中（常规抗生素含量），此时你的牛牛菌依旧年轻奔放而活力四射，依旧220 rpm 37度，保证要有大量泡沫，然后你可以去吃饭和睡午觉了，当然，别忘了把诱导剂拿出来放在4度化冻。
2小时或2个半小时后，也就是1点到2点之间，你的菌液OD600已经可以达到了0.5-0.6了，此时加入诱导剂，比如IPTG，诱导3小时，依旧是快摇，保证有大量泡沫，哦，诱导时盖子要有缝隙，保证外界空气能进去。放心，有抗生素和优势菌在，外面的菌进去活不长。
5点到5点半，收菌，4度10000G离心10 min，弃上清得到沉淀。
此时你有几种选择，第一，把菌冻起来回家吃晚饭，一切明天再说；第二，吃完晚饭过来，不嫌麻烦的话用预冷的PBS重悬菌，再离心以去除某些杂质（反正我是不做这一步的）；第三，把装菌的离心管扔到液氮里，再拿出来室温化冻，加入你用的裂解液（根据Novagen的建议），然后放到摇床上200 rpm 摇10min，裂解液就可以把菌块全化了。
如果你迫不得已或者打算餐后做消食运动，可以进行菌液的裂解。要不然就留给明天吧。
在这里强烈推荐Novagen的BugBuster Mix，很好用，参照它的说明就可完成裂解。不足之处是贵了点。
Lysis A 裂解液配方：50 mM Tris.Cl，5 mM EDTA，150 mM NaCl，0.5% TritonX-100，0.5%去氧胆酸钠，pH 8.0 （这个配方也许源于分子克隆，但是自己想当然配的，没看分子克隆）。
Lysis B 裂解液配方：50 mM Tris.Cl，150 mM NaCl，0.5% TritonX100，pH 8.0。
Lysis A 一般是1g湿菌加入10-20ml 裂解。
此时你有两个选择，第一，超声波破碎菌体（我从不玩机械破碎）；第二，加入终浓度25-30 U/ml 的Benzonase和终浓度为1KU/ml 的rLysozyme，37度摇床30min。实际上，我经常画蛇添足地先超声再加酶摇。
4度16000 G 15 min，得到沉淀。
重悬沉淀用Lysis B，无论你想用涡旋还是吸管吹，都没问题，加多少LysisB也没影响，只要能悬散就行，如果不放心，还可以加入rLysozyme或者Benzonase，浓度同上，室温或37度晃荡10min。
为何用Lysis B？嗯，如果你的下游实验是IMAC，大概不希望EDTA螯合你的柱子上的金属离子，而且，剔除作为阳离子去污剂的去氧胆酸钠也没什么坏处。当然，可以用无EDTA的蛋白酶抑制剂替代EDTA，然后不加去氧胆酸钠，那么你就只需要一种类似于BugBuster的裂解液了。当然，我不知道BugBuster的配方，也不想另加蛋白酶抑制剂。
用重悬后的沉淀可以10000G离心10min后再用LysisB重悬，这个步骤可以做3次，然后用PBS重悬一次（PBS量可以大一点，以充分稀释TritonX100），16000 G 15 min，得到的就是包涵体了。
到这里可以冻上，也可以加进变性液变性，无论6M盐酸胍或8M尿素，带上0.2M磷酸盐或者参照分子克隆配方，但保证pH8.0为宜。感觉变性液吹不散包涵体的话，可以超声（大功率、间歇）打散包涵体，放心，三四百瓦特的功率打不碎蛋白，只会打烂核酸。你可以让它37度摇1小时到3小时，或者室温、4度之类过夜，有变性剂在，你的蛋白很安全。
包涵体表达小技巧之二：机器玩重折叠
以Ni柱结合His为例，市售Sepharose柱子或者NTA都行，差别是，NTA有更多的金属离子结合位点，理论上说能结合更多蛋白，而且NTA能承受的压力上限要高一些。这里的重折叠过程不太适合超滤的步骤，仅针对IMAC。
柱子结合Ni可参照说明书，结合后，建议将水洗过程换成复性液洗涤，复性液配方为：8M尿素或者6M盐酸胍，0.2M醋酸，pH4.0。酸性条件不利于蛋白上柱，所以洗一次就行，剔除结合未稳的Ni和柱子表面可能有的杂质，然后加入你用的变性液洗涤平衡柱子，使柱子适应pH8.0的环境。不过千万别总把柱子泡在变性液里。
加入变性好的蛋白溶液，室温1小时振荡结合即可，不要太剧烈，保证柱子不沉下去就行。
我们在使用超滤时，往往无法避免蛋白在重折叠过程中发生聚集的情况，所以加入DTT以防止S-S的形成。而对于上柱的蛋白，优势在于，可以直接在柱子上重折叠，而不必担心蛋白间形成聚集沉淀，缺点就是不能大量生产。
以机器纯化为例，使用FPLC或者AKTA。
变性液（A），重折叠液（B），重折叠液即为剔除了变性剂的A。
N种方案，捡几种来说。
A液为起始100%，B液为终末100%，逐渐用B液完全替代A液，对20ml以内Ni柱，设总体积300毫升洗涤，流量为0.8ml/min，压力上限对NTA为0.5，对Sepharose为0.3，其实实际运行中很少超过0.1。
在开始你会看到屏幕上UV值暴涨，那是因为很多未结合和结合不稳的蛋白被洗脱，里面有目标蛋白也有杂蛋白，不用管，1小时后UV值就会下降到一个恒定值。这个过程会持续约6小时，随后可以看到B液浓度开始走水平，表明过柱的已经是100%的B液了。不要急着收，让其再运行30min。这时目标蛋白就完成了重折叠。可以参考常规洗脱办法了。
注意在这个方法中，不含有任何还原剂，如DTT或2巯基乙醇或者还原型谷胱甘肽，仅有变性液含有变性剂，仅有洗脱液含有咪唑（500mM），全部剔除甘油。所需液体仅三种：变性液、重折叠液、洗脱液。如果觉得配置6M盐酸胍或8M尿素是一种痛苦，以上步骤不失是一种简单实用的技术。当然，整个过程最好在4度，最起码也得用冰水不间断流过柱子外围，保证纯化的蛋白具有活性。一般认为，8M尿素在4度会析出结晶，所以推荐6M盐酸胍，实际上，由于整个过程液体都在流动，8M尿素不会析出，它仅仅比盐酸胍在静止状态下容易析出，两者析出特点的区别仅仅在于尿素在4度会更短时间就析出，而盐酸胍花的时间更长。
两个建议：
一、重折叠液可以是pH8.0，也可以是pH6.0这样的酸性，根据你的蛋白最后要的工作条件。如果你的蛋白需要在弱酸性条件或中性条件下工作，建议将重折叠液调为pH6.0，然后洗脱液和透析液也是pH6.0。如果重折叠液是pH8.0，洗脱液是pH6.0，一些天生具有聚集特性的蛋白可能在透析时发生小范围聚集，但会让人很不爽。pH6.0的重折叠液也有缺点，就是蛋白容易在重折叠过程中损失一些，因为弱酸性条件并不利于His挂Ni柱，但这个损失很少，相反可以洗掉很多非特异蛋白。有一些老式步骤中使用低浓度咪唑（比如10 mM）来剔除非特异结合，结果是一样的。
二、这个重折叠可以设定为总量400ml，流速0.5ml/min，那么晚饭后做上就可以回家睡大觉了，第二天早上再来洗脱，不过确保过夜的液体得够啊。
‘包涵体表达小技巧之三：手工玩重折叠
手动步骤是无法使用机器的下策。
所有液体配方同机器纯化方案，但重折叠过程略作修改。
A液洗涤数次，直到你感觉行了，一般是3-5次，每次5倍柱体积，洗涤过程最好是4度摇床缓慢振荡，以不使柱子沉淀的强度为宜，每次2min足矣。每次洗了都要低速离心（1000 G 5min），弃上清。
设N个梯度，每个5倍柱体积，A:B体积比分别为：10/0，9/1，8/2……1/9，0/10。依次洗下来以使B液缓慢替代A液。每次洗同样是4度轻振荡2min，5倍柱体积，然后低速离心弃上清。最后还要用100%的B液洗两次，保证干净
关于pH值，与机器洗涤方法同样。
一些额外的建议：
一、以His标签为例，如果你感觉6xHis标签会影响下游试验，那么分析你的蛋白序列，如果自带10个以上His，不妨在构建质粒时选没有标签的载体，一样可以很好结合，只是要保证手动洗涤时不会剧烈振荡。如果你担心蛋白自身的His结合柱子之后会影响重折叠，实际上要是带了His标签的蛋白也是无法保证结合柱子的都是标签的蛋白，而且根据我手上的FTIR结果，利用蛋白自身的His结合后得到的重折叠蛋白依旧是类似天然构象。
二、如果无法保证在4度完成重折叠和洗脱过程，那么就按原始方案保留A、B液和洗脱液中的甘油。不过透析液中最好不要有甘油。
三、透析之前，务必清楚自己的透析袋的MWCO值，别把目标蛋白透出去了。以上步骤得到的蛋白透析过程相对简单，加进100倍蛋白体积的透析液，4度透析1-3小时，再换100倍体积新透析液透析4小时或者过夜就行了。如果不放心里面的咪唑，还可以多透一两次。
强调：透析液最好不要是dd水，而是缓冲液。可以根据自己的下游实验自行设计透析液。但是最好不要带有下游实验反应缓冲液中不存在的成分。比如，你的下游试验如果是蛋白相互作用，而缓冲液不含钾离子，那么透析液也就不要含钾离子。
该方法同样适用于GST之类标签的需要重折叠的蛋白。透析后的蛋白若感觉浓度不够可以用超滤管浓缩，同样务必注意超滤管的MWCO……
包涵体表达小技巧之四：柱子回收与再利用
勤俭持家是中华民族的传统美德，如果你想节约自己的柱子，就和胖胖一起玩柱子回收吧。
以市售Sepharose（常用的所谓Fast Flow）和NTA柱子为例。
洗脱蛋白后的柱子，实际上还是很脏，N多杂质在上面，还有很多目标蛋白，算了，洗不下来就忍了。
步骤：
10倍柱体积0.5M NaOH洗柱1次，弃上清；
10倍柱体积水洗1-2次；
5倍体积复性液（6M盐酸胍或8M尿素，0.2M醋酸，pH4.0）洗柱一次。PS：一般NaOH洗后有棕色沉淀，而复性液洗后有白色沉淀，都是乱七八糟的蛋白——实际上，pH4.0条件会让蛋白掉下来，推理到纯化过程的洗脱一步，如果你不想用咪唑置换His，那不妨用pH4.0的洗脱液，如果你的蛋白不怕酸的话。
10倍柱体积水洗1-2次；
到这里，你的柱子可以再经20%乙醇或0.5M NaOH洗一次，就可保存到相应的保护液里面了。如果柱子已经经历了3次蛋白纯化，那么可继续进行下面步骤。
水洗后的柱子加入2倍柱体积0.2%SDS洗1次；
10倍体积水洗1次以去除SDS；
2倍体积25%乙醇洗1次；
2倍体积50%乙醇洗1次；
2倍体积75%乙醇洗1次；
5倍体积100%乙醇洗1次；
2倍体积75%乙醇洗1次；
2倍体积50%乙醇洗1次；
2倍体积25%乙醇洗1次；
10倍体积水洗1次；
5倍体积100 mM EDTA洗1次，这时柱子应该恢复成白色，因为金属离子被螯合了。
10倍体积水洗1-2次，完全去掉EDTA；
加入你用的金属离子重新结合柱子，室温1小时够了；
10倍体积水洗1次，以去掉没结合的金属离子；
5倍体积复性液洗1次；
到这里，再用你柱子保存液洗柱1次就可以把柱子保存起来了。
到了该让蛋白结合柱子的时候，可以再拿复性液洗1次，然后变性液洗1-2次，让柱子适应了pH8.0的变性环境，就可以加入蛋白变性后的溶液了。
对于用His结合柱子的蛋白，不推荐使用还原剂如DTT、2巯基乙醇或还原型谷胱甘肽，如果你的蛋白很大（>100kDa），可以在变性时少量加入还原剂，但还原剂影响蛋白结合柱子。要用就用稳定的2巯基乙醇，如果下游要注射到动物或上细胞，也不必害怕2巯基乙醇的毒性，因为整个纯化洗脱透析过程已经把最开始的那点东西踢得干干净净了